С конца XV в. Московское княжество, окончательно освободившись от золотоордынской зависимости, начало более активно собирать под свое начало восточнославянские земли. Идеологическим обоснованием этой политики была миссия защиты православной веры. Уже Василий I Дмитриевич стал именовать себя Великим князем, государем Московским и «всея Руси». В 50-х годах XV в. отношения между двумя государствами регулировались договором 1449 г. Казимира и Василия II, известным как «Великий акт раздела Руси между Москвою и Вильно». В 80 - 90-е годы сепаратистские промосковские настроения в ВКЛ получили значительный размах. Участились переходы православной знати на сторону Москвы. С конца 80-х и 90-е годы в Московское государство перешли князья Белевские, Бельские, Воротынские, Вяземские, Можайские, Мерецкие, Шемятичи вместе со своими уделами, т.е. подвластными им землями.

Обострились отношения между ВКЛ и Крымским ханством, возникшем в 1443 г. после распада Золотой Орды. Населению южных и центральных земель княжества приходилось защищать свои земли от набегов крымских татар. Кроме того, великокняжеская казна выплачивала так называемую ордынщину, направленную на утихомиривание татар. Их агрессию смогли остановить военные успехи великокняжеского войска в битвах под Клецком и у Ольшаница (Киевщина).

Конфронтация между московским княжеством и ВКЛ привела сначала к приграничным войнам (1487 - 1494 гг.). В эти годы воеводы Ивана III нападали и грабили восточные земли ВКЛ. В 1494 г. было подписано мирное соглашение, по которому к Московскому государству отошли Вяземское княжество и земли в бассейне верхней Оки. Кроме того, князь ВКЛ Александр женился на дочери Ивана III Елене. Но и это не сделало союз прочным. Вскоре, найдя повод, (Александр в одной из своих грамот не назвал Ивана III «государем всея Руси») Иван III объявил войну ВКЛ. 14 июня 1500 г. на реке Ведрош, недалеко от г. Дорогобужа войско ВКЛ потерпело поражение. Результатом войны явился мирный договор 1503 г, по которому к Москве отошли Чернигов, Новгород-Северский, Гомель, Брянск, Путивль, Стародуб, Мценек, Невель, Велиж и др. В целом ВКЛ потеряло 19 городов и 70 волостей.

Положение ВКЛ осложнило восстание в 1508г. Михаила Глинского. Он выступил против верховной власти ВКЛ. Целью восстания явилось «возрождение киевской монархии», т.е. образование самостоятельного от ВКЛ государства, ядром которого стали бы восточные белорусские и украинские земли. По согласованию с Великим князем Московским Василием III и при поддержке князей Друцких, Мстиславских Глинский напал на Туров и Мозырь, осадил Минск. Ему на помощь поспешили московские войска. Но противостоять войскам Сигизмунда I не смогли. Широкой поддержки сепаратистски настроенные феодалы и население белорусских земель Глинскому не оказали. Восстание окончилось поражением.

В августе 1508 г. было подписано соглашение о «вечном мире» между Московским княжеством и ВКЛ, закреплявшее границы, сложившиеся в результате предыдущих войн. В 1512 г. снова возобновились боевые действия. Московские войска овладели Смоленском и начали наступление в направлении Друцка и Орши. 8 сентября 1514 г. под Оршей 80-тысячная русская армия потерпела поражение от 30-тысячного войска ВКЛ, которым командовал гетман Константин Острожский . Борьба продолжалась с переменным успехом. Такие города, как Полоцк, Мстиславль, Витебск, Гомель, Орша, Рогачев, Смоленск разрушались по несколько раз. В 1522 г. было подписано пятилетнее перемирие, которое потом было продлено еще до 1533 г. В 1534 г. началась новая война. Смерть Василия III в Московском государстве подтолкнула ВКЛ к реваншу за возращение утраченных ранее территорий. Война продолжалась четыре года. ВКЛ вернуло только Гомель. Себеж и Заволочье оставались за Москвой.

Внешнеполитическая ситуация и внутреннее положение в ВКЛ вынудили правящие круги предпринять меры по привлечению белорусской знати к руководству государством. С начала XVI в. проводится линия на уравнивание в правах представителей шляхетского сословия независимо от этнического происхождения и религиозной принадлежности. Эти изменения способствовали преодолению сепаратизма белорусских феодалов. После восстания Глинского среди знати не было оппозиционных группировок, разногласий по политическим, этническим, или религиозным признакам.